Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo Giberelin

iii
SUMMARY

The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae
disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of
gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to
08/2007 at Nong Lam university.
In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields.
In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different
geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological
characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to
study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names
to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of
morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to
make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as
showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all
previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14
isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella
fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to
identify GA
3
but our experiment did not go as well as planned.



iv
MỤC LỤC

Lời cảm tạ i
Tóm tắt luận văn ii
Summary iii
Mục lục iv
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng, hình, sơ đồ viii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2
1.2.1 Mục tiêu 2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von 3
2.1.1 Phân bố và thiệt hại 3
2.1.2 Triệu chứng 3
2.1.3 Tác nhân 5
2.1.4 Hình dạng và kích thước 6
2.1.5 Đặc tính sinh lý 6
2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển 7
2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi 8
2.2.1 Phân loại học 8
2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi 8
2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi 9
2.3 Giới thiệu về gen tef 10
2.4 Tổng quát về giberelins 11
2.4.1 Đại cương về các chất giberelins 11
2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa 13

v
2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị 13
2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành 14
2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính 14
2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” 14
2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt 14
2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại 15
2.4.3.1 Trong trồng trọt 15
2.4.3.2 Sản xuất bia 15
2.4.3.3 Tăng sản lượng mía 15
2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật 16
2.5 Sắc ký lớp mỏng 16
2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng 16
2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng 20
2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC 20
2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 20
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 22
3.1.1 Thời gian nghiên cứu 22
3.1.2 Địa điểm thực hiện 22
3.2 Vật liệu nghiên cứu 23
3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm 23
3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 23
3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 24
3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm 25
3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử 25
3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối 25
3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm 26
3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 26
3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA 26

vi
3.3.2.3 Định tính DNA 27
3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích 28
3.3.3 Khuếch đại vùng tef 28
3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28
3.3.3.2 Thực hiện phản ứng 29
3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR 29
3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA
3
29
3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 29
3.4.2 Phương pháp sản xuất GA
3
30
3.4.3 Phương pháp trích GA
3
30
3.4.4 Định tính GA
3
bằng TLC 31
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL 32
4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử 33
4.3 Kết quả nhân sinh khối 35
4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm 36
4.5 Kết quả PCR 38
4.6 Kết quả định tính GA
3
bằng TLC 39
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1 Kết luận 41
5.2 Đề nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC







vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AcOH: acid acetic.
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
BVTV: bảo vệ thực vật.
bp: base pair.
CHCl
3
: chloroform.
dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long.
EtOAc: ethyl acetate.
HPLC: high performance liquid chromatography.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
GAs: giberelins.
GA
3
: acid giberelic.
Gf: Gibberella fujikuroi
MP: mating population.
PCR: polymerase chain reaction.
PDA: potato dextrose agar.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid.
Rf: ratio of fronts.
STT: số thứ tự.
TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate.
TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate.
tef : translation elongation factor.
TLC: thin-layer chromatography.
Tm: melting temperature.
UV: ultra violet.
WA: water agar.

viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG

Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von 4
Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh 5
Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme 5
Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic 11
Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene 11
Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane 12
Hình 2.7 GA
3
kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao 13
Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA
3
đến giống nho không hạt của Thompson 15
Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC 19
Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh 33
Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA 33
Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy 34
Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy 34
Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme 35
Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme 35
Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 36
Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 37
Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef 39
Hình 4.10 Kết quả sắc ký 40

Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA
3
ở Gibberella fujikuroi 9
Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium 10
Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA
3
30
Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA
3
31

Bảng 3.1 Các dòng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL 23
Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR 29
1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản
xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn
năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam
trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình.
Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã
trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nó được xem là nguồn cung cấp
lương thực chủ yếu của người Châu Á nói chung cũng như là người Việt Nam nói riêng.
Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất
hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này có thể do nhiều tác
nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra.
Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa có thể kể như lúa von,
đạo ôn, khô vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ
Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An
Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh
có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm
đòng (http://www.laodong.com.vn) và đã làm giảm năng suất đáng kể.
Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100
năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa
von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất
là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã
xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi
này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài
2

Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai
đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài
sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về
nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme
gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và tác
nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đó là cơ sở để chọn ra các dòng
nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuôi cấy, lên men sản xuất giberelin.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh
lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR.
Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất
GA
3
và định tính GA
3
bằng TLC.
3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von
2.1.1 Phân bố và thiệt hại
Bệnh đã được biết đến ở Nhật từ năm 1828, nhưng mãi đến năm 1898 mới
được Hori mô tả lần đầu tiên. Bệnh khá phổ biến trên thế giới. Ở Trung Quốc bệnh
được gọi là „white stalk‟; còn ở Philippines và Guyana bệnh được gọi là „lúa đực‟
(palay lalake hay man rice). Thất thu do bệnh có thể rất đáng kể ở nhiều nơi, 20% ở
Hokkaido, 40 – 50% ở Kinki Chugoku, Nhật (Ito, Kimura, 1931; Kinki – Chugoku
Regional Agriculture Committee, 1975), 15% ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ
(Pavgi, Singh, 1964), 3,7 – 14,7% ở Trung và Bắc Thái Lan (Kanjanasoon, 1965).
Bệnh cũng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á nhưng thiệt hại không lớn. Ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long bệnh cũng có mặt ở nhiều nơi, nhất là vụ Đông Xuân,
mức độ thiệt hại tùy giống và tùy năm. Trên giống IR-42 ở Huyện Mỹ Xuyên, Sóc
Trăng, tỉ lệ chồi nhiễm có thể đến 10 – 20%. Bệnh có khi thành dịch trên diện rộng,
như vào năm 1980 ở Đồng Tháp.
2.1.2 Triệu chứng
Bệnh có thể xuất hiện ngay từ giai đoạn mạ. Triệu chứng dễ thấy và thông
thường nhất là cây mạ bị bệnh có chiều cao hơn cây bình thường, mảnh và có màu
xanh vàng nhạt. Cây mạ bị bệnh có thể chết trước khi nhổ cấy hay sau khi cấy.
Những cây này nổi bật lên rất dễ thấy, nó phân bố khắp cánh đồng. Tuy vậy cũng có
một số cây mạ bị bệnh không có triệu chứng von mà lại thấp lùn còi cọc, phụ thuộc
vào dòng nấm gây bệnh và các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ và ẩm độ.
4

















Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh.
Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra có 5 loại triệu chứng.
Vươn dài.
Vươn dài sau đó phát triển bình thường.
Vươn dài sau đó bị còi cọc.
Cây bị còi cọc.
Cây không phát triển.
Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến có đòng. Những cây bị
bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đôi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng
hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đó là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này
lan dần lên trên khi cây chết. Nấm có thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu
điều kiện thuận lợi.

Hình 2.1 Ruộng lúa ở Càng Long -Trà Vinh bị nhiễm
bệnh lúa von tại thời điểm 01/05/2007.

Xem chi tiết: Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo Giberelin